3. PCR testy
PCR testy byly v době pandemie hodně skloňované a sloužily jako hlavní nástroj k detekci onemocnění covid-19. V této kapitole se jim podíváme na zub a vysvětlíme si princip, na jakém fungují. Dále se dozvíš, jaké mají výhody a nevýhody a co všechno k jejich provedení potřebujeme.
Celý proces začíná izolací nukleové kyseliny
PCR test detekuje přítomnost virové RNA v odebraném vzorku, tudíž nám určuje aktivní infekci v okamžiku odběru. V prvním kroku před samotnou PCR reakcí je tedy třeba nejprve nukleové kyseliny z odebíraného vzorku vyizolovat. Izolační protokoly a postupy se mohou napříč laboratořemi lišit, ale vždy obsahují stejné základní kroky:
- Lýze buněk – při ní buňky popraskají a jejich obsah se uvolní do roztoku;
- Separace nukleových kyselin – je třeba oddělit a očistit nukleové kyseliny od ostatních molekul, které nás nezajímají (např. proteiny, lipidy apod.);
- Zakoncentrování nukleových kyselin – výsledkem jsou koncentrované nukleové kyseliny v roztoku.
PCR – polymerázová řetězová reakce
PCR testy jsou založené na tzv. polymerázové řetězové reakci. Při ní dochází k mnohonásobnému zmnožení určitého úseku DNA, který může být dále využit v celé řadě laboratorních technik nebo testů. To, co k proběhnutí PCR reakce nezbytně potřebujeme, je tedy zkoumaná DNA, kterou jsme získali izolací. Dále jsou to specifické primery – uměle nasyntetizované krátké úseky DNA, které označí námi zvolený úsek k množení, a v neposlední řadě enzym polymeráza, který zajistí namnožení. PCR reakce se odehrává v přístroji zvaném termocykler, který umožňuje dle předchozího nastavení potřebné střídání teplot.
V prvním kroku reakce se vlivem vysoké teploty DNA vlákno rozplete na dva řetězce, tento proces se nazývá denaturace. Následně na jednotlivá vlákna nasednou primery, které označí požadovaný úsek DNA, a nakonec enzym zvaný Taq polymeráza dosyntetizuje nové vlákno. Z jedné dvoušroubovice DNA nám tak vzniknou její dvě identické kopie. Tento proces nazýváme jako jeden cyklus, přičemž v rámci jednoho PCR běhu jich necháme proběhnout asi 30–40. Kopie našeho úseku DNA přitom přibývají exponenciálně, protože každá namnožená molekula je v dalším cyklu opět rozpletena a dosyntetizována. Po jednom cyklu tak získáme 2 kopie, po dvou cyklech jsou to 4 kopie a po 40 cyklech jsou to už miliardy kopií. Takovéto množství kopií jsme schopni dalšími technikami změřit či detekovat.
Zjisti více: Historie PCR
PCR metoda byla popsána teoreticky už v roce 1971, ale první, kdo byl schopen ji realizovat a považujeme ho za jejího objevitele, byl americký vědec Kary Mullis v roce 1983. Dle jeho vlastních slov ho ta myšlenka jen tak napadla, když jel autem po dálnici 128 ze San Francisca do Mendocino County. Deset let po této cestě, tedy v roce 1993, obdržel za vynález PCR Nobelovu cenu za chemii.
Co je to RT-qPCR test?
PCR metoda, tak jak ji objevil Kary Mullis, prodělala v průběhu let řadu modifikací, které se vztahují ke konkrétním experimentům či aplikacím. Při detekci viru SARS-Cov-2 se používá varianta RT-qPCR, která obsahuje hned dvě vylepšení základní metody.
Pokud sis přečetl první kapitolu pečlivě, už víš, že virus SARS-Cov-2 patří mezi skupinu RNA virů a neobsahuje tedy DNA, ale RNA. Z toho důvodu je PCR reakci předřazená tzv. reverzní transkripce (RT). V tomto kroku je virová RNA obsažená ve vzorku přepsána do jí odpovídající DNA. Ta pak vstupuje do PCR reakce.
„Přepsání RNA do DNA se děje za přítomnosti enzymu polymerázy. Zatímco při PCR reakci využíváme Taq polymerázu, při reverzní transkripci se uplatňuje její „sestra“ – reverzní transkriptáza. Výslednou DNA nazýváme jako komplementární k naší RNA a označujeme ji zkratkou cDNA.“
qPCR je označení pro kvantitativní PCR (označuje se také jako Real-time PCR), což je jedna z důležitých variant klasické PCR reakce. Zatímco u běžné PCR analyzujeme až výsledný namnožený DNA produkt, u qPCR sledujeme nárust produktu v reálném čase. Amplifikace (tj. proces množení) každého cyklu je zaznamenávána pomocí optického zařízení, které snímá fluorescenci použitích sond navázaných na DNA. Zní to možná složitě, ale ve skutečnosti je to celkem jednoduché. Kromě komponent, které se přidávají do běžné PCR, jsou do qPCR navíc přidány ještě fluorescenční látky, tzv. sondy, které se taktéž specificky váží na naši DNA. Ve chvíli, kdy začne docházet k amplifikaci, optické zařízení zaznamená fluorescenční signál. Čím více kopií se v reakci s každým dalším cyklem nachází, tím více fluorescence detekujeme.
Na obrázku lze vidět typickou křivku qPCR reakce, kdy na ose x je vyznačen počet proběhnutých cyklů a na ose y naměřená fluorescence. Na začátku běhu je v reakci jen malé množství PCR produktu, tím pádem je detekována nízká fluorescence. Tato fáze bývá označována jako signál pozadí. V okamžiku, kdy je PCR produkt dostatečně amplifikován, vstupuje do tzv. exponenciální fáze, při níž je s každým cyklem množství produktu zdvojnásobeno. Ke konci reakce, kdy jsou všechny reagencie vyčerpány, se amplifikace začne zpomalovat, a nakonec se zastaví. Jako Ct hodnotu určujeme cyklus, při němž detekovaná fluorescence PCR produktu překoná fluorescenci pozadí.
Zpátky k SARS-Cov-2
Bez toho, aniž bychom znali genomovou sekvenci viru SARS-Cov-2, by jeho detekce pomocí PCR nikdy nemohla fungovat. Za to vděčíme vědcům po celém světě, kteří hned se začátkem pandemie začali virus od nemocných izolovat, pomocí sekvenačních metod získali tuto informaci a navzájem ji sdíleli. Na základě znalosti přesné sekvence viru totiž mohla být vybrána specifická místa, pro která byly následně navrženy primery a sondy.
„Genom = soubor veškeré genetické informace konkrétního organismu.
Sekvence = přesné pořadí jednotlivých nukleotidů v úseku nukleové kyseliny.“
Pojďme si tedy spolu projít celý proces PCR testu na SARS-Cov-2. Nejprve je testovanému člověku pomocí štětičky odebrán vzorek z úst, krku či nosu. Z této štětičky jsou pak v laboratoři vyizolovány nukleové kyseliny včetně virové RNA, pokud je přítomná. Pomocí kroku nazvaného reverzní transkripce je tato virová RNA převedena na komplementární cDNA a vzorek následně vstupuje do qPCR reakce. Při ní na cDNA viru nasedají primery a fluorescenční sondy, načež dochází k množení úseku a nárustu fluorescence, který jsme schopni detekovat. Získáváme tedy křivku podobnou, jako je na obrázku výše, a vzorek můžeme označit za pozitivní. Pokud již od začátku vzorek neobsahuje žádný virový genetický materiál, primery a sondy nemají kam nasednout a nedojde ani k množení, ani k fluorescenci. Přístroj nezaznamená žádnou křivku a vzorek lze označit jako negativní.
Falešná pozitivita a negativita
Pokud u člověka, který ve skutečnosti infikovaný není, získáme pozitivní výsledek testu, hovoříme o falešné pozitivitě. Příčinou falešně pozitivního testu bývá nejčastěji nějaký druh kontaminace jiným pozitivním materiálem. Může to být přímo kontaminace vzorku nebo kontaminace používaných reagencií či laboratorních pomůcek. K falešně pozitivnímu výsledku může také dojít obyčejnou lidskou chybou, jako je např. záměna vzorků.
Naopak negativní výsledek infikovaného člověka označujeme jako falešně negativní. K falešné negativitě vedou nejčastěji chyby na začátku celého procesu, tj. při odběru vzorku (špatně provedený odběr, pacient před odběrem pil či jedl) nebo při izolaci.
Proto, aby se těmto jevům co nejvíce zamezilo, jsou při PCR testování SARS-Cov-2 praktikovány další kontrolní postupy. Do vzorku bývá přidávána tzv. interní kontrola, jejíž křivka nám na konci ukazuje, zda proces izolace a PCR reakce proběhl správně. Dále bývá souběžně se vzorkem analyzován také negativní a pozitivní referenční materiál, u kterého si lze potvrdit očekávaný výsledek a neznámý vzorek s ním porovnat.
Kromě pozitivity či negativity lze z qPCR testu vyčíst ještě jeden parametr týkající se infekce, a sice virovou nálož. Je to ten parametr, na jehož základě lze s rozvahou označit vzorek za silně pozitivní, či slabě pozitivní. Schopnost určit počáteční virovou nálož vychází z principu samotné qPCR reakce. Pokud ve vzorku máme na počátku velké množství templátové DNA, bude stačit relativně málo cyklů k tomu, abychom získali dostatečné množství produktu s detekovatelnou fluorescencí. Jinými slovy – amplifikace se rozběhne rychleji. Naopak při malém množství templátové DNA bude tento proces trvat výrazně déle a fluorescence se objeví až při vyšším počtu cyklů.
„Jak už víme z této kapitoly, cyklus, při němž hodnota fluorescence překročí určitou hranici, se nazývá Ct hodnota. Tento poznatek tedy lze vyjádřit tak, že nízká Ct hodnota = vysoká virová nálož, vysoká Ct hodnota = nízká virová nálož.“
Zatímco u vzorků s nízkou Ct hodnotou, a tedy silnou pozitivitou, není příliš o čem polemizovat, laboratorní skupina MZ ČR varuje před interpretací infekčnosti u vzorků s vysokou Ct hodnotou, tedy slabě pozitivních. Nízká virová nálož se totiž vyskytuje jak u pacientů na konci onemocnění, kdy značí odeznívající nemoc a sníženou infekčnost, tak u pacientů, kteří jsou teprve na počátku infekce a v blízké době u nich může virová nálož a infekčnost významně stoupat. V případech vysokých Ct hodnot je proto potřeba umět od sebe tyto dva případy, tedy počátek a konec infekce, rozeznat.