3. Výběr antibiotika aneb na co je mikrob citlivý?
Jakým způsobem můžeme stanovit citlivost anebo rezistenci mikroba k antibiotikům? Jak předcházíme vzniku rezistence?
V předcházejících kapitolách se nám podařilo získat pomocí kultivace, mikroskopie a biochemických metod kmen určitého druhu mikroorganismu, který pocházel ze zaslaného vzorku. Předpokládejme tedy, že tento kmen Streptococcus pyogenes je odpovědný za infekci, kvůli které vzorek klinický lékař zaslal do mikrobiologické laboratoře. Abychom mohli navrhnout klinickému lékaři vhodné antibiotikum, na které bude daný kmen citlivý, musíme provést stanovení citlivosti k antibiotikům. Ta se stanovuje především fenotypovými metodami, které se dělí na kvalitativní průkaz citlivosti a kvantitativní stanovení citlivosti. Ke kvalitativnímu průkazu se používá nejčastěji disková difuzní metoda, ke kvantitativnímu stanovení citlivosti slouží především stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) mikrodiluční metodou.
Disková difúzní metoda
Tato metoda patří mezi rutinní vyšetření a užívá se pro stanovení citlivosti anebo rezistence k antimikrobním látkám na základě velikosti zóny, která se vytvoří po předepsané době inkubace kolem disku, napuštěného určitou antimikrobní látkou (např. antibiotikem).
Aby byl výsledek testu spolehlivý, musí se přesně dodržovat předepsaný postup. Do Petriho misky o průměru 9 cm se nalije 25 ml uvařeného a sterilizovaného média, což vytvoří vrstvu 4 mm vysokou. Následně provedeme očkování roztěrem, to znamená, že 1 ml inokula o hustotě 0,5 McFarlanda pečlivě rozetřeme po povrchu agaru pomocí hokejky nebo špičky a případný přebytek odsajeme anebo provedeme roztěr vatovým tampónem. Po naočkování klademe na zaschlý povrch antibiotické disky a inkubujeme 18 hodin při 35–37 °C.
Hustota inokula - McFarland
Inokulum znamená mikrobiální suspenzi určitého druhu mikroba v tekutém médiu. Abychom orientačně věděli, kolik je mikrobiálních buněk v inokulu, použijeme tzv. denzitometr, což je vlastně jednoduchý fotometr a změříme denzitu (hustotu) suspenze v jednotkách McFarland. McFarlandova zákalová stupnice byla historicky připravena smícháním roztoků chloridu barnatého a kyseliny sírové a vzniklá sraženina síranu barnatého tvořila základ pro přípravu zákalové stupnice.
Po inkubaci se výsledky odečtou, to znamená, že se změří průměry inhibičních zón, porovnají se s referenčními hodnotami, a na základě toho jsou zařazeny do kategorie citlivý (C), intermediárně rezistentní (I) nebo rezistentní (R) k určité antimikrobiální látce. Referenční hodnoty získáme z tabulek EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) na stránkách Státního zdravotního ústavu.
Stanovení MIC - Mikrodiluční metoda
Stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) mikrodiluční metodou se provádí při vyšetřování citlivosti kmenů, které byly izolovány z krve anebo u mikrobů vypěstovaných z klinicky závažných případů.
Tato metoda je užívána k určení minimální koncentrace antibiotika, potřebného k inhibici růstu vyšetřované bakterie a současně nám umožňuje stanovit citlivost nebo rezistenci daného kmene. Stanovení provádíme v mikrotitračních destičkách, které mají 96 jamek s rovným dnem. Pomocí multikanálových pipet do destiček pipetujeme médium a antibiotika. Jedna destička obvykle slouží pro kultivaci jednoho kmene s několika různými antibiotiky v osmi různých koncentracích, které získáme ředěním přímo v jamkách. Do jamek očkujeme inokulum o hustotě 0,5 McFarlanda, výsledná koncentrace v jamkách by měla být 104–105 CFU/ml.
CFU - Colony Forming Unit
Pro většinu testů se připravuje inokulum o denzitě 0,5 – 1 McFarland, což odpovídá 1 – 2x108 CFU/ml Escherichia coli. (CFU Colony Forming Unit neboli KTJ - kolonie tvořících jednotek). Jednotky CFU/ml nebo CFU/g používáme v případě, že potřebujeme stanovit počet mikroorganismů ve vzorku.
Po stanovené době inkubace odečteme hodnotu minimální inhibiční koncentrace (MIC) jako nejnižší koncentraci antimikrobiální látky bez viditelného růstu mikroorganismů (zákal, sediment). Odečítání hodnot MIC je vizuální, případně spektrofotometrické za použití readeru. MIC se obvykle vyjadřuje v µg/ml nebo v mg/l. Výsledky jsou porovnány s tabulkami breakpointů EUCAST. Klinické breakpointy jsou používány v klinických laboratořích k optimalizaci léčby pacienta a předcházení vzniku rezistence v důsledku užití nesprávného antibiotika v nevhodné koncentraci. Kmeny, jejichž MIC je nižší než stanovený breakpoint (rozhraní mezi citlivým a rezistentním kmenem), jsou k dané antimikrobiální látce citlivé. Kmeny, jejichž MIC je vyšší než breakpoint, jsou k dané antimikrobiální látce rezistentní.
Laboratorní křížovka
Procvičte si pojmy a údaje, které jsme probrali v této kapitole.